2018. január – NAP 1.0 különszám: Nemzeti Agykutatási Program
2018. január – NAP 1.0 különszám: Nemzeti Agykutatási Program

Az első SBEM Magyarországon

Az MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetben, a Nemzeti Agykutatási Program és az MTA infrastruktúrafejlesztési pályázatainak köszönhetően megvalósult új Serial Block-face Scanning Electron Microscope (SBEM) központ vezetőjét, Nyiri Gábort kérdeztük az új agykutatási technológiával és az annak segítségével tervezett kutatásaikkal kapcsolatban.


Nyiri Gábor és kutatócsoportjának munkáját másfél évtizede segítik a különböző transzmissziós elektronmikroszkópos technikák, azonban a Winfried Denk és Heinz Horstmann kutatók által 2004-ben először leírt pásztázó elektronmikroszkópos technológia új lehetőségeket kínál az agykutatás számára.

Hogyan segíti a kutatásokat az első magyarországi SBEM mikroszkóp?

– Az idegsejtek közötti kommunikáció vizsgálata az egyik alapvető kérdés az agykutatásban. Az idegsejtek kapcsolatai (a szinapszisok) azonban olyan kicsik, hogy pontos szerkezetük – a legmodernebb fénymikroszkópos fejlesztések ellenére is – csupán elektronmikroszkópban vizsgálható.

Mára a különböző festési eljárások és elektronmikroszkópia kombinálásával sokat megtudtunk arról, hogy a különböző szinapszisokban milyen fehérjék vannak, és mely idegsejtek kapcsolódnak egymással, illetve, hogy ezek a kapcsolatok a sejtek mely nyúlvá­-nyain találhatók. A kérdések megválaszolására legtöbbször rövi­debb sorozatmetszeteket készítettünk, majd ezek mindegyikén meg­keresve és lefényképezve az adott kapcsolatokat, képesek voltunk három dimenzióban rekonstruálni a szinapszisokat. Azonban ehhez a minták előkészítése, metszése, sorozatfényképezése, rekonstrukció esetén pedig a fényképek illesztése hosszadalmas volt, így ennél jóval hatékonyabb módszerre volt szükség ahhoz, hogy a kapcsolatok ezreit létesítő idegsejtek kapcsolati viszonyait vizsgálni tudjuk.

Többféle technológiai fejlesztés is történt ezeknek a munkáknak a felgyorsítására pásztázó elektronmikroszkópok segítségével, melyekből három fő típus létezik. Az egyik típus külön készülékben szalagra veszi fel a 30–70 nanométer vastag elektronmikroszkópos metszeteket, majd azokat pásztázza az elektronmikroszkópban. Egy másik típus egy ionsugár segítségével metszi a szövetblokk felszínét (csak viszonylag kicsi területen), és metszés után pásztázza annak felszínét a készülékben.

Az MTA KOKI-ban folyó agykutatási kérdéseinkhez azonban a legjobban az úgynevezett Serial Block-face Scanning Electron Microscope illik, amelynek működése elvben egyszerű. A gyantába ágyazott agyszövetblokk a készülék vákuumterébe kerül, és a felszínéről egy pásztázó elektronnyaláb képet készít. (A kép rajzolata ugyanolyan, mint a klasszikus transzmissziós elektronmikroszkóp készülékekben, csak itt a nehézfémek nem kitakarják az elektronnyalábot a kamera elől, hanem épp innen verődnek vissza az elektronok a detektorba. Az eredmény ugyanolyan kép lesz.) Ezután a vákuumtérben egy gyémántkés lemetsz egy 30–100 nano­méter vastag réteget a szövetblokk tetejéről (erre a metszetre már nem lesz szükség), majd az így feltárult új felszínt a készülék újra pásztázza. Ez a ciklus tetszőleges számban ismétlődhet, akár napokon keresztül.

A Serial Block-face Scanning Electron Microscope.

Azáltal, hogy nagyobb részt önműködően, egy készülékben történik az agyszövet metszése, a metszetek fényképezése és az elkészült képek illesztése, az SBEM készülék feladattól függően legalább egy-két nagyságrenddel felgyorsítja az ilyen típusú rekonstrukciós munkákat.

Ez azt jelenti, hogy az SBEM mikroszkóp kiváltja a többi elektronmikroszkóp feladatát az agykutatásban?

– Nem, természetesen továbbra is mérlegelni kell majd, hogy mely munkákhoz, melyik készülék a legalkalmasabb. Az SBEM nagy előnye, hogy lényegesen nagyobb területek rendkívül hosszú sorozatainak tökéletesen illeszkedő képeit készíti el úgy, hogy az idegi profilok nem torzulnak, mivel a kép nem a gyémántkés által maga előtt tolt és hártyára felvett metszetről, hanem mindig a még érintetlen blokk felszínéről készül. Kvantitatív anatómiai vizsgálatokhoz ez ideális. Ugyanakkor az SBEM felbontása valamivel kisebb (3–5 nanométer), mint például a transzmissziós elektronmikroszkópok által elérhető mintegy 1 nanométeres felbontás, az utóbbi mikroszkóp használata hatékonyabb a háromdimenziós rekonstrukciót nem igénylő feladatoknál. Így az elektronmikroszkópos technológiák egymást kiegészítik.

A FEI Apreo VolumeScope vákuumterének szerkezete.
Milyen kutatásokat terveznek elsőként az új készülékkel?

– Az SBEM gyártói neve, a VolumeScope elnevezés is arra utal, hogy a fejlesztők elsődleges célja nagyobb festetlen szövet-„tér­fo­gatok” vizsgálatának segítése volt. Azonban mi mind festetlen, mind festett szöveteket vizsgálni fogunk. A készülék akár órákig (vagy napokig) is tud önállóan metszeni és fényképezni, akár 0,5 × 0,5 milliméter nagyságú területen is. Mi is igyekszünk kihasználni a nagyobb térfogatok vizsgálatának előnyeit az Európai Unió által támogatott Human Brain Project keretében folyó vizsgálatainkban, melyek célja az emlős agy idegsejtjeinek nagyobb léptékű modellezése. Célunk az emberi és egér idegsejtek különböző típusainak vizsgálata, nyúlványaik térfogati, felszíni paramétereinek, tüskéik térfogatainak elemzése egészséges és Alzheimer-kóros mintákon.

Bardóczi Zsuzsanna és Papp Péter SBEM készülékkel dolgozik.

Intézetünk csoportjainak lehetőségük lesz számos egyéb, új típusú kérdés megválaszolására, mivel az SBEM-mel nyerhető adatok mennyisége akár olyan változások kimutatására is alkalmas, melyeket eddig – a klasszikus, lassabb módszerek miatti korlátozott elemszám miatt – nem is remélhettünk. Genetikai elváltozások, emberi betegségek vizsgálata vagy akár gyógyszerhatások is vizsgálhatók lesznek például a szinaptikus struktúrák vagy a tüske­térfogatok változásának tanulmányozásával. Jó példa erre Luisa de Vivo és társainak tanulmánya a Science folyóirat 2017. februári számában, amelyben főleg SBEM adatokra támaszkodva vizsgálták a szinaptikus változásokat alvás/ébrenlét során.

Az új készülékkel az agykéreg szövetéről készült képen az idegsejtkapcsolatok (szinapszisok) is jól látszanak.

Ugyanakkor az SBEM nemcsak a nagyobb térfogatú festetlen szövetek vizsgálatához optimális, de óriási segítség lesz a Nemzeti Agykutatási Program (NAP 2) által támogatott projektekben is, me­lyekben az MTA KOKI-ban több évtizedes hagyományokkal rendelkező molekuláris neuroanatómiai módszereket alkalmazzuk. Ezekben például antitestek használatával azonosíthatjuk a vizsgált idegsejtkapcsolatok molekuláris összetételét, majd az SBEM segítségével azokat sokkal nagyobb számban és rövidebb idő alatt elemezhetjük. Ezek segítségével vizsgáljuk új, eddig az emlős agyban nem ismert idegpályák molekuláris összetéte­lét, kapcsolatrendszerét, illetve esetleges részvételét emberi neurodegeneratív megbetegedésekben, mint amilyen például az Alzheimer-kór.•

217. december

 

 
Archívum
 2011  2012  2013  2014  2015  2016  2017  2018

Innotéka